ALS4中特异性表达克隆扩增的CD8+T细胞

木易小小

ALS4中特异性表达克隆扩增的CD8+T细胞

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华西商教授团队

肌萎缩侧索硬化（ALS）是最常见的一种运动神经元病类型，目前为止发现部分基因能导致疾病的发生，如SOD1，C9orf72重复扩增等，这些基因的异常被证实与神经炎症息息相关关。例如C9orf72主要在脾CD11b+细胞及小胶质细胞中表达，C9orf72敲除小鼠可出现自身免疫表型；TBK1突变可导致自噬和固有免疫激活小胶质细胞作为神经系统中固有的免疫细胞等。其中ALS4型为SETX基因突变导致的早发、进展较缓慢的ALS，SETX基因主要用于调控DNA/RNA稳定性，其功能丧失可导致RNA代谢异常及IFN-1免疫激活，而SETX导致的错义突变（ALS4的主要类型）产生的神经免疫变化不明。

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近期发表在Nature的一篇研究针对SETX的错义突变对其进行了免疫细胞分群及功能鉴定，揭示了ALS4的免疫特征。

       方法学

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该研究通过建立ALS4小鼠模型（SetxL389S+/- knock-in小鼠），对其进行流式分选、单细胞测序、免疫细胞分群、TCR测序及克隆扩增鉴定等实验方法来探究ALS4的免疫学特征；最后选取ALS4及健康对照（HC）病人外周血及尸检组织进行验证。

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       结果

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      1. ALS4建模及固有免疫反应

研究人员成功建立SetxL389S+/- knock-in（KI组）小鼠（转棒实验验证），并将其与WT、kno ck-out小鼠体外培养的骨髓来源树突状系细胞进行IFN-1免疫反应验证，发现无论外源性激活与否，仅Setx knock-out组IFN-1表达升高，而SetxL389S+/- knock-in小鼠IFN-1表达与WT无差别。提示SETX错义突变不参与IFN-1相关的免疫反应。

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       2. ALS4模型T细胞分群

由于前期部分神经退行性疾病研究发现AD, PD, DLB中均可见CD4/CD8 T细胞激活，研究人员对构建的ALS4小鼠模型脑组织、脊髓及外周血进行单细胞质谱流式检测，发现KI组与WT组之间免疫细胞亚型无差别，但是KI组CD8+T细胞的表达标记物PD-1表达升高，且在脊髓、脑组织升高较外周血早 。

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       3. PD-1+ CD8+ T细胞表型

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   为探究这些高表达的PD-1+ CD8+ T细胞的具体类型，研究人员继续对外周血CD8+ T细胞表达的效应分子进行流式及SMART转录组测序，发现这些PD-1+ CD8+ T细胞主要为TIGIThighTOXhighTCF-1low细胞，这些细胞为终末效应记忆T细胞（TEMRA）表现 。

       4. PD-1+ CD8+ T细胞克隆扩增

  ALS4小鼠模型脑组织中分选出PD-1+ CD8+ T细胞及PD-1- CD8+ T细胞并对其进行TCR受体测序，发现PD-1+ CD8+ T细胞克隆扩增能力增强，即大量T细胞克隆同一片段的TCR；且在脊髓及外周血中有类型表现，并互相扩增序列存在交集，提示PD-1+ CD8+ T细胞可通过CNS循环于外周血 。

为明确引起克隆扩增T细胞的来源，即判断免疫激活的T细胞是否是外源性抗原产生，研究者将KI小鼠与OT-1小鼠杂交，并发现仅少数OT-1细胞表达PD-1，而大量PD-1+细胞为non-TCR transgenic CD8+ T细胞，提示KI鼠免疫激活不是靠外源性抗原OVA产生。因此KI小鼠中存在内源性抗原介导的CD8+ T细胞激活，而非刺激非特异性免疫激活造成，而这种现象可能是神经退行的原因或者是结果。

       5. ALS4小鼠中存在抗肿瘤免疫

前部分研究发现KI小鼠中存在CD8+ T细胞激活可能是由于内源性抗原介导，为进一步验证，研究者提出若存在内源性免疫激活，则该自身已激活的CD8+ T细胞可保护小鼠不受肿瘤细胞表达的同源抗原影响。研究者在KI和WT小鼠中注射诱导高级别胶质瘤/黑色素瘤细胞系，发现KI组中胶质瘤较WT组小，而黑色素瘤组无变化；且KI小鼠胶质瘤组织中存在大量CD8+ T浸润，这些浸润的CD8+ T细胞和KI鼠脊髓来源的PD-1+ CD8+ T细胞存在大量相同序列的TCR，提示KI小鼠可能存在CNS来源的内源性抗原并激活CD8+ T细胞。

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     6. ALS4小鼠免疫激活对运动功能影响

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为了探究免疫激活对神经系统及运动功能的影响，研究者进行了骨髓移植实验，将小鼠进行辐照清除骨髓中的免疫细胞，再人为移植不同形式的骨髓细胞（KI鼠骨髓细胞/WT组骨髓细胞），从而构建出四组小鼠模型（KI-WT组：KI小鼠骨髓细胞移植进WT小鼠，SetxL389S突变仅存在于免疫系统中；WT-KI组：WT小鼠骨髓系细胞移植进KI小鼠，SetxL389S突变仅存在于神经系统中；KI-KI组及WT-WT组），结果发现仅KI-KI组运动能力最弱，且轴突退变程度最大，而其它之间无差别，提示当SetxL389S突变均存在于免疫系统及神经系统时才能引起疾病的发展。

     7. ALS4病人中CD8+T细胞表达情况

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研究人员又继续在ALS4病人上进行免疫细胞分群验证，对5名ALS4（SetxL389S突变）及10名HC外周血单核细胞进行CITE-seq发现ALS4 CD8+ T细胞升高，且主要为TEMRA表达升高，且TCR测序也发现存在大量T细胞克隆扩增 。此外对2名ALS4型进行尸检发现CD8+T细胞主要存在于腰端脊髓腹侧角。

       结论

研究首次通过大量的实验及技术分析出ALS4型免疫表型的改变，对ALS疾病中T细胞的功能特点指出了方向，适应性免疫功能或许是未来监测ALS4疾病进展的标志物。

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原文链接：ALS4中特异性表达克隆扩增的CD8+T细胞

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