C9orf72相关额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化症的脑脊液生物标记物分析方法的开发

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C9orf72相关额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化症的

脑脊液生物标记物分析方法的开发

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       梅斯医学：C9orf72第一内含子的GGCC重复序列扩增是肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞痴呆症（FTD）最常见的遗传原因，分别占家族病例的38%和25%。健康人通常有两个重复，而C9FTD/ALS（C9FTD/ALS）患者可以携带数百到数千个重复序列。重复序列在正反方向上转录，导致形成称为RNA病灶的RNA聚集体。此外，重复扩增的重复相关非ATG翻译导致二肽重复蛋白（DPR）的产生。翻译发生在正反义转录本的所有三个框架中，产生五种不同的二肽物种：聚（GA）、聚（GP）、聚（GR）、聚（PR）和聚（PA）。针对C9orf72重复扩增的疗法，如小分子、 12个反义寡核苷酸（ASOs）、13–18个siRNA、19个microRNA和基于CRISPR的方法正在迅速发展。在人类iPSC-neuros和C9orf72小鼠模型中，以重复扩增或C9orf72转录物为靶点的ASOs可降低RNA病灶和DPR水平。

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       为了将治疗从试验台推进到床边，需要反映目标参与的疾病生物标志物。一个重要的突破是，通过中尺度发现（MSD）免疫分析，可以在C9FTD/ALS患者的脑脊液（CSF）中检测到多聚体（GP），表明其作为参与生物标记物的潜力。脑脊液中的聚糖蛋白水平未发现与临床疾病标志物或神经丝脑脊液水平相关，后者是神经退行性变的非疾病特异性生物标志物。令人鼓舞的是，ASO治疗小鼠模型已被证明可导致脑组织和小鼠脑脊液中持久的聚（GP）水平降低，最近的一项研究显示C9orf72 ALS患者的脑脊液聚（GP）水平降低，表明脑脊液聚（GP）水平可作为药效生物标记物。

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       单分子阵列（Simoa）平台测量与微珠结合的免疫复合物，微珠在微孔阵列中分离，大小足以容纳单个微珠。Simoa平台使用数字检测技术实现单分子检测。由于聚（GP）是脑脊液中最直接的DPR测定方法，利用Simoa技术开发了一种灵敏、合格的聚（GP）测定方法。经过广泛的分析开发和鉴定，测量了通过遗传FTD计划（GENFI）收集的脑脊液中的多聚糖蛋白水平。C9orf72基因的GGCC重复扩增是遗传性额颞叶痴呆（FTD）和肌萎缩侧索硬化（ALS）的最常见原因。随着针对重复扩张的潜在疗法进入临床试验，迫切需要对靶点参与进行敏感的生物标记物分析。本文目标是开发这样一种检测方法。

       55名参与者来自GENFI，这是一项基于欧洲和加拿大27个地点的遗传FTD自然史研究。27名参与者包括15名症状性C9orf72扩张携带者（14名为行为变异性FTD（bvFTD），1名为ALS），25名症状前C9orf72扩张携带者和15名非携带者亲属作为对照。致病性C9orf72扩增长度定义为重复引物PCR鉴定的30多个重复。参与者包括23名男性和32名女性 女性，样本采集时的平均年龄（SD）为49.4（13.9）岁。疾病组中：症状前C9orf72扩张携带者、11名男性和14名女性 女性，41.0（10）岁，症状性C9orf72扩张携带者，男性10名，女性5名 女性，64.7岁（8.5岁）。在同一时期招募了15名健康对照者：2名男性和13名男性 女性，48.2岁（11.2岁）。招募了20名阿尔茨海默病（AD）参与者。

       收集、处理脑脊液和血浆，并将其分等份储存在实验室−根据标准化程序，温度为80℃。在Simoa HD-1分析仪上使用multiplex Neurology 4-Plex A试剂盒（102153，Quanterix，Billerica，Massachusetts）测量8名匹配的症状性C9orf72脑脊液供体、10名匹配的症状前脑脊液供体和5名匹配的健康对照脑脊液供体的血浆神经丝轻链（NfL）浓度。兔多克隆抗体“GP57”和“GP60”是用合成多肽GP（32）作为抗原产生。通过试验对聚（GP）Simoa试验进行优化：两步与三步试验设计，检测器抗体浓度从0.3μg/mL到1.5μg/mL，链霉亲和素-β-D-半乳糖苷酶（SBG）浓度从50 pM到150 pM，以不同比例加入辅助珠，或者根本不加入。并行运行多个分析组合，以选择最佳条件。使用单分子阵列（Simoa）平台开发了一种免疫分析方法，用于测量C9orf72相关FTD/ALS患者脑脊液（CSF）中C9orf72重复扩增产生的聚（GP）二肽重复蛋白（DPR）。

       本研究提出的分析具有高度的灵敏度和鲁棒性，通过了广泛的鉴定标准，包括板内和板间变异性低、测量校准品和样品的高精度和准确性、稀释平行性、样品和标准冻融耐受性，以及无血红蛋白干扰。我们使用这种方法来测量通过遗传FTD倡议收集的CSF样本中的多聚体（GP）（N=40 C9orf72和15个对照组）。我们发现它具有100%的特异性和100%的敏感性，以及一个检测目标结合的大窗口，因为具有最低poly（GP）信号的C9orf72脑脊液样本的信号比对照组高八倍，C9orf72样本的平均值比对照组高38倍，均低于分析的定量下限。这些数据表明，基于Simoa的聚（GP）DPR分析适合用于临床试验，以确定旨在减少含C9orf72重复序列转录本的治疗药物的靶向参与。

       与症状前携带者相比，症状携带者的poly（GP）水平高于平均水平，但这种差异并不显著。我们观察到，随着捐献年龄的增加，polyGP水平有升高的趋势，有症状携带者的年龄越大，可能有助于这种效果，尽管我们注意到，在18-24个月的纵向检测中，聚GP水平保持稳定。有一名有症状的C9orf72携带者的多聚体（GP）水平远远高于其他携带者。发病年龄（66岁）和献血年龄（68岁）与其他有症状献血者的平均值相比均在1 SD以内，表明较高水平的聚糖蛋白（GP）对这些参数没有影响。

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       总之，本文展示了Simoa HD-X平台用于检测C9orf72扩增患者CSF中的多聚体（GP）的实用性，其分析可靠性足以用于直接靶向C9orf72重复序列转录本的临床试验中的靶向结合分析。

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       原文链接：JNNP：C9orf72相关额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化症的脑脊液生物标记物分析方法的开发

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